1. Модель механосенсирования искусственной клетки В биологических системах избирательно проницаемая...
2. Мембранное отклонение и сжатие пневматическим управлением
3. Улавливание двойных эмульсий
4. Обратимая компрессия двойных эмульсий
5. Удаление масла аспирацией двойных эмульсий
6. Механически активированная двойная эмульсия посредством аспирации и осмотического шока облегчает транспортировку...

Модель механосенсирования искусственной клетки

В биологических системах избирательно проницаемая мембрана состоит из тонкого одиночного бислоя молекул липидов толщиной ~ 5 нм. Мембранные белки, такие как транспортеры и ионные каналы, важны для контроля транспорта химических веществ и ионов через мембрану. Механочувствительные каналы, которые реагируют на натяжение мембран, обнаруживаются от бактерий (например, MscL) к клеткам млекопитающих (например, Piezo 1). 35 , 36 , Воссоздание механочувствительной активности канала как пути к созданию механочувствительной искусственной клетки является сложным, но многообещающим подходом. В качестве альтернативы модели липидных бислойных везикул двойные эмульсионные капли могут быть использованы для создания прототипа искусственных клеток ( Рис. 1а ). Поскольку вода и масло не смешиваются друг с другом, средняя масляная фаза разделяет внутреннюю и внешнюю водные фазы с образованием двойной эмульсии. Толщина нефти диктует перенос гидрофобных растворенных веществ через диффузию 37 или обратными мицеллами при наличии осмотического несоответствия 38 , Для создания прототипа механосенсирования искусственных клеток мы исследовали возможность использования сжатия и аспирации для изменения толщины масла в двойной эмульсии в качестве механизма механической активации искусственных клеток ( Рис. 1б ).

Рисунок 1. Прототипирование механосенсоров искусственных клеток.

(а) Липидный бислой разделяет внутреннюю среду клетки, где ионы не пересекаются. Двойная эмульсия может служить моделью искусственной ячейки, в которой средняя фаза масла может изменяться по толщине и действует как полупроницаемый барьер для прохождения ионов. (b) Микрожидкостное устройство можно использовать для сжатия или аспирации двойных эмульсий в качестве способа изменения толщины масла и механической активации искусственных клеток.

Обзор и дизайн микрофлюидного устройства

Чтобы продемонстрировать конструкцию механосенсирования искусственных клеток, микрофлюидное устройство предназначено для улавливания двойных эмульсий в улавливающих камерах и для параллельного применения сжатия и аспирации к двойным эмульсиям. Устройство, выполненное из полидиметилсилоксана (ПДМС), имеет два слоя: слой потока и контрольный слой ( Рис. 2a – d ). Проточный слой (синий) имеет конструкцию, аналогичную описанной ранее в нашем приборе для микрофлюидной пипеточной матрицы (μFPA). 34 где жидкость и двойные эмульсии текут из одного входа через микрофлюидный канал в один выход. Микрожидкостный канал сначала разделяется на два канала, каждый из которых содержит 7 камер захвата. Каждая камера захвата соединена с противоположным концом основного микрофлюидального канала через небольшой микроканал, похожий на микропипетку, которая может выполнять аспирацию. Слой потока спроектирован таким образом, что сопротивление потока небольшого микроканала в 20 раз больше, чем сопротивление основного микрофлюидального канала. Таким образом, поток направляется в основном через основной микрофлюидальный канал, а не через камеры улавливания. Тонкая мембрана PDMS разделяет микрофлюидный канал и контрольные слои (розовый и оранжевый), которые выполняют две разные функции и контролируются независимо ( Рис. 2б ). Чтобы направить поток в камеры захвата, пневмоуправляемый набор клапанов, расположенный над микрофлюидным каналом, блокирует поток в основном микрофлюидном канале, когда набор клапанов (регулирующий клапан 1, розовый) активирован. Второй набор регулирующих клапанов (набор регулирующих клапанов 2, оранжевый) непосредственно над улавливающими камерами при сжатии приводит к сжатию до захваченной двойной эмульсии. Поскольку двумя наборами регулирующих клапанов можно управлять независимо, захват не связан со сжатием.

Рисунок 2: Обзор и дизайн микрофлюидного устройства.

(а) Показана конструкция микрофлюидного устройства. Устройство имеет два слоя PDMS, которые состоят из деформируемого микрофлюидного канала и двух независимых наборов регулирующих клапанов. (б) Крупный план комплектов регулирующих клапанов из пунктирной рамки в ( а ). Комплект управляющих клапанов 1 облегчает захват капель внутри камер захвата, а комплект управляющих клапанов 2 обеспечивает сжатие захваченных капель в плоскости. (c) Вид сверху (справа) и вид сбоку (слева) камеры улавливания. Микрожидкостной канал находится под контрольным слоем и отделен тонкой деформируемой мембраной PDMS. Структура пипетки, примыкающая к камере улавливания, расположена на дне микрожидкостного канала. (d) Изображение фактического устройства, соединенного с микротрубками: красители синего и красного цвета обозначают микрофлюидный канал и наборы регулирующих клапанов соответственно, масштабная шкала = 3 мм.

Мембранное отклонение и сжатие пневматическим управлением

Одной из особенностей, которые имеет микрофлюидное устройство, является сжатие захваченных двойных эмульсий в улавливающих камерах. Комплект регулирующих клапанов 2 имеет прямоугольную форму над каждой камерой захвата. Когда регулирующий клапан 2 находится под давлением, мембрана PDMS над улавливающими камерами отклоняется и сжимает двойные эмульсии, улавливаемые в улавливающих камерах. Прямоугольные структуры набора управляющих клапанов 2 должны быть совмещены с улавливающими камерами микрофлюидального канала ( Рис. 3а ) таким образом, что отклонение мембраны PDMS происходит непосредственно над улавливающими камерами. Без приведения в действие мембрана остается плоской. Когда давление воздуха в наборе 2 регулирующих клапанов увеличивается и превышает давление жидкости в микрофлюидном канале, мембрана PDMS отклоняется к каналу потока ( Рис. 3б ). Отклонение мембраны зависит от свойств материала мембраны PDMS, толщины мембраны и приложенного давления в наборе регулирующих клапанов 2. Изготовить мембрану PDMS с более высокой эластичностью для лучшего прогиба по сравнению с PDMS с 10: 1 ( основа: отвердитель) соотношение компонентов 39 Мы выбрали более высокое соотношение смешивания 20: 1, чтобы сделать мембрану PDMS. Изменяя скорость центрифугирования PDMS на кремниевой форме в поточном слое (1000–1600 об / мин), мы можем создать мембрану PDMS с толщиной от 20 до 44 мкм. Чтобы исследовать прогибы мембраны с различной толщиной в зависимости от различных приложенных давлений, мы пометили объем микрожидкостного канала родаминовым сукцинимидиловым красителем, поскольку мы не можем непосредственно маркировать мембрану PDMS. Когда регулирующий клапан 2 находится под давлением, мембрана отклоняет и вытесняет жидкость в микрофлюидном канале, так что мы можем косвенно визуализировать отклонение мембраны. Восстановленные трехмерные и боковые изображения сжатых улавливающих камер показали увеличение прогиба мембраны с увеличением приложенного давления ( Рис. 2с ). Важно отметить, что мембрана PDMS контактирует с нижней частью канала потока при 30, 25 и 20 фунт / кв.дюйм для устройств со скоростями центробежного покрытия PDMS 1000, 1200 и 1600 об / мин соответственно. Измеряя прогиб мембраны, мы обнаружили, что процент прогиба является линейным с приложенным давлением для данной толщины мембраны PDMS ( Рис. 2d ). Когда толщина мембраны PDMS уменьшается за счет увеличения скорости нанесения покрытия, мы обнаружили большее отклонение при том же приложенном давлении. Оба эти результата согласуются с механической интуицией отклонения пластины.

Рисунок 3: Характеристика прогиба мембраны PDMS при повышении давления в контрольном слое 2.

( a ) Вид сверху: комплект регулирующих клапанов 2 совмещен с улавливающими камерами в микрожидкостном канале. ( b ) Вид сбоку: давление воздуха в наборе регулирующих клапанов 2 регулируется регулятором давления. При нулевом давлении мембрана между комплектом управляющего клапана 2 и микрофлюидным каналом является плоской. Когда регулирующий клапан 2 находится под давлением, мембрана отклоняется. ( c ) Изображения из конфокальной микроскопии флуоресцентного красителя, перфузированного в микрофлюидном канале. Изображения Z-стека были реконструированы в ImageJ для генерации трехмерных изображений и изображений бокового обзора. Показаны прогибы мембраны PDMS с разной скоростью центрифугирования при различном прилагаемом давлении, масштабная шкала = 50 мкм. ( d ) Процентное отклонение мембраны из PDMS в зависимости от скорости вращения покрытия PDMS и приложенного давления (n = 4). Толщина мембраны PDMS t (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) была измерена для каждой скорости центрифугирования.

Чтобы определить идеальную скорость вращения и толщину мембраны для микрожидкостного устройства, мы рассмотрели два критерия: прочность соединения PDMS и прочность мембраны на разрыв. Хотя подложки PDMS были обработаны кислородно-плазменной обработкой перед соединением вместе, достаточно высокое давление воздуха могло разорвать соединение PDMS, что привело к закупорке микрофлюидного канала. Следовательно, более тонкая мембрана была предпочтительна в этом отношении, потому что более тонкая мембрана PDMS полностью блокировала микрофлюидный канал при более низком прилагаемом давлении. Однако, когда мембрана PDMS была слишком тонкой, процесс изготовления устройства стал более сложным из-за проблем со связыванием. Исходя из этих соображений, мы изготовили и работали с микрофлюидными устройствами со скоростью вращения PDMS 1200 об / мин на кремниевой кристаллизаторе проточного слоя, от которого мембрана отклоняется и полностью блокирует проточный канал при 25 фунт / кв. Дюйм.

Улавливание двойных эмульсий

Двойные эмульсии были захвачены внутри микрофлюидного устройства для приложения механических сил. Двойные эмульсии диаметром от 40 до 90 мкм сначала генерировали в стеклянном капиллярном микрофлюидном устройстве ( Рис. S1 ) и затем повторно вводят в микрофлюидное устройство при 10-кратном разбавлении. Чтобы уловить двойные эмульсии в улавливающих камерах, в наборе управляющих клапанов 1 затем было давление 10–15 фунтов на кв. Дюйм, чтобы заблокировать основной микрофлюидальный канал, что увеличило сопротивление потока в главном микрофлюидном канале. В результате отношение сопротивления потоку между микроканалами и основным микрофлюидным каналом будет уменьшаться, и через микроканалы будет проходить больше потоков жидкости. Это значительно повышает эффективность улавливания двойных эмульсий, и мы обычно обнаруживаем, что все 14 улавливающих камер заполняются в течение минуты. Двойная эмульсия будет захвачена, если радиус двойной эмульсии меньше мгновенной критической ширины потока, что определяется отношением сопротивления потока между микропипеткой и основным микрофлюидным каналом 40 , Поэтому двойную эмульсию большего диаметра обычно сложнее уловить; однако при активации набора управляющих клапанов 1 микрофлюидное устройство успешно улавливало двойные эмульсии диаметром 46, 68 и 90 мкм, как показано на Рис. 4а ,

Рисунок 4: Улавливание и сжатие двойных эмульсий внутри улавливающих камер.

(а) Двойные эмульсии разных размеров были уловлены в улавливающих камерах, масштабная шкала = 50 мкм. (b) Двойные эмульсии, захваченные внутри улавливающих камер, деформировались при различных давлениях воздуха, подаваемых на комплект регулирующих клапанов 2. Двойные эмульсионные капли были сдавлены при сжатии и возвращены обратно в сферическую форму после сжатия. (c) Изменения средней толщины в плоскости средней масляной фазы в зависимости от приложенного давления для двух капель разного размера (n = 3, среднее значение ± SEM). Средняя толщина в плоскости рассчитывается путем усреднения наибольшей толщины и наименьшей толщины двойной эмульсии. (d) Средняя толщина в плоскости средней масляной фазы для двух капель разного размера до и после сжатия (n = 3, среднее значение ± SEM).

Обратимая компрессия двойных эмульсий

После демонстрации успешного улавливания двойных эмульсий мы оценили влияние сжатия на двойные эмульсии. Комплект регулирующих клапанов 2 предназначен для сжатия двойных эмульсий внутри улавливающих камер. Из-за свойств жидкости внутренней водной и средней масляной фаз двойные эмульсии легко деформируются, когда они испытывают различные внешние поля потока 41 , 42 , Но когда внешняя нагрузка снимается, двойные эмульсии возвращаются к своим первоначальным сферическим формам из-за межфазного натяжения. Когда мы увеличили приложенное давление в наборе управляющих клапанов 2 и сжали захваченные двойные эмульсии, средняя толщина масляной фазы в плоскости увеличилась. Двойные эмульсии диаметром 50 и 80 мкм прессовали с использованием давления воздуха до 20 и 15 фунтов на кв. Дюйм соответственно ( Рис. 4б ). При давлении воздуха 20 фунтов на кв. Дюйм двойные эмульсии 80 мкм выходили из улавливающих камер из-за ограниченного пространства внутри улавливающих камер и их больших размеров. Для двойных эмульсий обоих размеров компрессия изменила их форму и толщину масла. Рисунок 4с показывает увеличение средней толщины в плоскости средней масляной фазы с увеличением приложенного давления. Двойные эмульсии с наружным диаметром 50 мкм имели увеличение средней фазы в 3,8 раза, в то время как двойные эмульсии 80 мкм наблюдались в 2,3 раза. Изменение средней толщины в плоскости средней масляной фазы было полностью обратимым, когда после сжатия давление снизилось до 0 фунтов на квадратный дюйм ( Рис. 4d ). Вместе эти результаты показали способность микрофлюидного устройства сжимать двойные эмульсии для увеличения толщины их средней масляной фазы.

Удаление масла аспирацией двойных эмульсий

Двойные эмульсии очень стабильны, и масло должно быть удалено, чтобы разбавить масляную фазу. Мы предположили, что аспирация средней нефтяной фазы может привести к постоянному истончению нефтяной фазы. Аспирация достигается с помощью того же механизма, который использовался ранее в устройстве μFPA. 34 , Перепад давления на микроканале возникает из-за падения давления в главном микрофлюидном канале из-за потока жидкости ( Рис. 5а ), который является произведением объемного расхода и сопротивления потока основного микрофлюидального канала. Чтобы определить соотношение между расходом и перепадом давления для каждой улавливающей камеры для нашей относительно сложной конструкции микрожидкостного канала, мы выполнили моделирование потока в канале потока с использованием COMSOL. Как показано в Рис. 5б перепад давления является линейным с расходом для каждой улавливающей камеры, с наибольшим перепадом давления для самой входной камеры улавливания.

Рисунок 5: Истончение средней фазы в двойных эмульсионных каплях путем аспирации.

(a) Микрожидкостный канал проточного слоя сконструирован таким образом, что захваченные капли в улавливающих камерах испытывают перепад давления, вызванный потоком жидкости в микрожидкостном канале. (b) Соотношение между расходом и перепадом давления в разных положениях улавливающей камеры было получено из моделирования COMSOL. (c) Двойная эмульсионная капля, захваченная в камере захвата, отсасывалась путем изменения перепада давления. По мере увеличения разности давлений масло переходило от всасывания к отжиму и истончению. Когда перепад давления уменьшился, масло отозвалось. После разжижения масла двойная эмульсия оставалась внутри улавливающей чашки, а первоначально капсулированный флуоресцентный краситель оставался в двойной эмульсии. (d) Изменение средней толщины в плоскости средней масляной фазы относительно времени для той же двойной эмульсии, показанной в ( с ), при перепаде давления 69,3 и 34,3 Па.

Чтобы проверить влияние аспирации на двойные эмульсии, мы инкапсулировали родамин сукцинимидиловый краситель в двойных эмульсиях 80 мкм, которые имели среднюю толщину масла в плоскости 8,2 мкм. Увеличивая скорость потока, мы вдыхали двойные эмульсии и наблюдали несколько вариантов поведения при динамическом изменении давления аспирации, как показано в Рис. 5с , При низком давлении аспирации, равном 8,5 или 21,3 Па, масло аспирировали в микропипетку. Интересно, что когда перепад давления увеличился с 34,6 до 69,3 Па, масло начало стягиваться, а средняя фаза истончалась в течение нескольких секунд. Переход масляной аспирации к отслаиванию происходит, когда длина выступа двойной эмульсии больше гидравлического радиуса аспирационной микропипетки. После применения высокого перепада давления к двойным эмульсиям в течение нескольких секунд (69,3 Па,> 5,8 с) масло в двойной эмульсии стало почти невидимым при визуализации в светлых полях. Однако в канале микропипетки осталось немного остаточного масла. Когда перепад давления снова уменьшился до 34,6 Па, масло отводили из канала микропипетки и заполняли среднюю фазу двойной эмульсии (34,6 Па, 1,5 с). Двойная эмульсия оставалась стабильно захваченной после разбавления масляной фазы, о чем свидетельствует неповрежденный инкапсулированный флуоресцентный краситель в водной внутренней фазе. Средняя толщина в плоскости средней масляной фазы этой одинарной двойной эмульсии была измерена при разнице давления аспирации 69,3 и 34,6 Па ( Рис. 5г ). Этот эксперимент продемонстрировал, что среднюю масляную фазу можно постоянно разбавлять путем аспирации в микрофлюидном устройстве.

Механически активированная двойная эмульсия посредством аспирации и осмотического шока облегчает транспортировку кальция через масло

Благодаря сжатию и аспирации микрожидкостное устройство обеспечивает кратковременное сгущение и постоянное истончение средней масляной фазы в двойных эмульсиях. Средняя масляная фаза в двойной эмульсии ведет себя как полупроницаемая мембрана, через которую молекулы растворенного вещества могут диффундировать в и из внутренней водной фазы. Это особенно актуально при применении для доставки лекарств, где неионизированный гидрофобный препарат диффундирует через масло, подчиняясь закону диффузии Фика. Поскольку ионы гидрофильны, они не могут легко диффундировать через нефть. Однако при наличии разницы осмотического давления во время гипоосмотического шока было обнаружено, что ионы могут также транспортироваться вместе с водой через масляную фазу двойных эмульсий, стабилизированную Span80, через два различных механизма. 43 , Когда нет контакта между двумя границами раздела, обратные мицеллы образуются в присутствии молекул липофильного поверхностно-активного вещества и диффундируют через масло, в то время как транспорт воды осуществляется отдельными молекулами гидратированного поверхностно-активного вещества, когда существует контакт между двумя границами раздела 43 , 44 , 45 , Также было установлено, что ионный транспорт зависит от растворимого в масле поверхностно-активного вещества. 43 , Было показано, что фторированное масло (HFE-7500) с фторсурфактантами (PFPE-PEG), используемое для создания двойных эмульсий в этом исследовании, обеспечивает проницаемость для кислорода и других неионизированных малых молекул. 46 , 47 , Однако транспорт ионов через это масло не известен. Таким образом, мы исследовали перенос ионов через среднюю нефтяную фазу как реакцию, которая включает механически возмущающие двойные эмульсии.

Чтобы обнаружить транспорт ионов кальция во время осмотического отката, мы инкапсулировали индикатор кальция Rhod-2 в двойные эмульсии ( Рис. 6а ). Мы не обнаружили значительного изменения флуоресценции при применении толстых двойных эмульсий с гипоосмотическим шоком ( Рис. S2 ). Однако, когда мы вдыхали двойные эмульсии для постоянного разжижения масла, ионы кальция быстро попадали в двойные эмульсии, на что указывает увеличение флуоресценции для индикатора кальция ( Рис. 6б ). Для сравнения, двойные эмульсии без аспирации, которые имели более толстую среднюю фазу, не имели повышенной флуоресценции во время осмотического отката в течение того же периода времени. Это указывает на то, что при аспирации двойных эмульсий с использованием микрофлюидного устройства ионы кальция во внешней фазе быстрее попадают в двойные эмульсии. Транспорт ионов через фторированное масло этой эмульсионной системы вел себя по-разному по сравнению с транспортом через гексадекан с Span80. 43 , Тем не менее мы продемонстрировали приток ионов кальция путем механической активации двухэмульсионной искусственной клетки.

( а ) Толстые двойные эмульсии аспирируют в микрофлюидном устройстве с образованием более тонких двойных эмульсий. Как толстые, так и тонкие двойные эмульсии подвергаются гипоосмотическому шоку, так что ионы кальция диффундируют через масло и попадают в двойные эмульсии. ( б ) Изменения флуоресценции как функции времени для толстых и тонких двойных эмульсий (n = 12, среднее значение ± SEM).

Похожие

Комментарии